1取材及冷凍

切取組織時(shí)應(yīng)使用鋒利的刀、剪，切取組織塊時(shí)，從刀的根部開始向后拉動(dòng)切開組織。組織塊的厚度約為0.2~0.3cm，大小為1.5cm×1.5cm x 0.3cm為宜。將要切取的平面朝下放到塑料包埋盒底部，在液氮表面停留約30秒把組織凍硬，注意停留太久易使組織凍裂。立即把凍硬的組織塊裝入自封袋中保存于-80℃低溫冰箱。

2切片 

切片前將組織樣本置于-20℃冰箱內(nèi)復(fù)溫30 min，切片厚度為5～7 μm，太厚貼片不牢固，更不利于鏡下觀察。包埋可用OCT,也可用膠水代替。用高粘度膠水在支撐架上滴加形成一個(gè)小臺(tái)，將組織放上，在組織周圍用膠水包埋一下放在冷臺(tái)上冷凍。包埋使組織上、下方有一定的邊，有利于連續(xù)切片，而且展片時(shí)可以避免組織皺縮。待組織達(dá)適當(dāng)硬度即可切片，切片時(shí)組織的冷凍程度是切片的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)，凍得過硬，切片呈碎屑狀；凍得不夠，切片呈粥糜狀或切不成片。

3貼片和固定

載玻片必須預(yù)先處理，常用多聚賴氨酸包被。需要注意多聚賴氨酸不可反復(fù)使用，且不能用玻璃容器存放。將切片小心貼附于載玻片上，貼片時(shí)手要穩(wěn)，并且手要有一個(gè)向下伸展的動(dòng)作，立即將切片放入固定液中。以往的經(jīng)驗(yàn)用吹風(fēng)機(jī)吹干再固定，但完全干后的組織容易在沖洗時(shí)脫片，并且組織細(xì)胞發(fā)生退行性變；另外，可溶性抗原不能晾干，應(yīng)立即固定。固定液的選擇因抗原而異，但一般抗原可用4℃預(yù)冷的丙酮固定15 min，此固定劑比較溫和，對(duì)抗原保存較好。

4  油紅O染色步驟

（1）切片用4%甲醛固定10分鐘；

（2）蒸餾水洗；

（3）60％異丙醇浸洗；

（4）油紅O染液10分鐘(染液可回收再利用)；

（5）60％異丙醇分色至背景無色；

（6）蒸餾水洗；

（7）Mayer蘇木精復(fù)染；

（8）自來水洗(藍(lán)化)1～3分鐘；

（9）蒸餾水洗；

（10）甘油明膠封片。

5 圖像采集

通過顯微鏡拍照，采集分析樣本相關(guān)部位。